蛋白質聚集和錯誤折疊是蛋白質治療劑生產中普遍存在的問題。細菌宿主是重組蛋白質的高效表達系統,但是細菌表達宿主內蛋白質產物的過表達常會產生大量聚集的、無活性的重組蛋白質包涵體。其他利用哺乳動物細胞、真菌或酵...[繼續(xù)閱讀]

    在從包涵體中復性蛋白質之前,必須首先使聚集體和包涵體溶解和變性。增溶中最常用的變性劑為尿素和鹽酸胍。這兩種促溶劑均為小分子,易于結合蛋白質,進而打破維持蛋白質結構的分子內和分子間作用力[5,6]。除尿素和鹽酸胍外...[繼續(xù)閱讀]

    當蛋白質完全溶解后,將其轉移至另一熱力學上有利于天然構象的溶液中來誘導復性。最常見的是通過降低促溶劑的濃度(采用稀釋或透析操作)至非變性水平來誘導蛋白質復性。當變性劑濃度下降至足夠低時,氨基酸之間的分子內作用...[繼續(xù)閱讀]

    伴隨著熱力學推動的蛋白質三維結構的折疊,二硫鍵也必須正確形成,才能獲得天然構象的蛋白質。盡管復性中形成正確二硫鍵的統計學概率比較低[10],但實際上通常可以以合理的效率形成天然二硫鍵。因此,我們推斷,蛋白質結構的折...[繼續(xù)閱讀]

    蛋白質的穩(wěn)定性和溶解性與能否成功提高復性產率密切相關。如果天然蛋白質在選擇的復性緩沖液中不能溶解,則復性不會發(fā)生。決定了使用何種能夠促進溶解的復性緩沖液后,還需了解可改善天然蛋白質的穩(wěn)定性和溶解性的緩沖液配...[繼續(xù)閱讀]

    在開始蛋白質復性之前,企業(yè)應該考慮一個策略問題,即選擇從包涵體中復性蛋白質還是考慮更換表達宿主生產正確折疊蛋白質。細胞培養(yǎng)開發(fā)團隊的特殊經驗可對這一決定加以指導。而且,哺乳動物細胞中表達的完全糖基化產物通常...[繼續(xù)閱讀]

    如果計劃開發(fā)復性過程,使用純化蛋白質將對過程開發(fā)具有很大的指導作用。如果可以獲得純化蛋白質,我們建議同時建立其在尿素和鹽酸胍中的展開曲線。文獻中可找到幾篇有關建立和解釋展開曲線的良好的實用指南[16,17]。一般通...[繼續(xù)閱讀]

    二硫鍵的存在對復性過程的開發(fā)增加了一定程度的復雜性。前文曾經提及,增溶階段二硫鍵必須被還原,而復性階段需被氧化。因此,對具有或沒有二硫鍵的蛋白質,我們提供不同的建議。4.3.3.1無二硫鍵蛋白質的復性當復性無二硫鍵的蛋...[繼續(xù)閱讀]

    測定復性是否成功的分析方法應根據復性結果加以選擇。不可溶的聚集體可以通過光散射技術(～320nm波長處紫外吸收或熒光散射)檢測。不可溶的產物也可以通過離心沉降,然后再次溶解并通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(S...[繼續(xù)閱讀]

    首次復性篩選完成后,可能會觀察到三個主要的結果:不可溶產物、可溶但錯誤折疊產物和含有可測定天然蛋白質的可溶性產物。根據首次復性篩選實驗中獲得的是可溶性還是不可溶性產物,改善復性的后續(xù)實驗設計策略的重點有所不...[繼續(xù)閱讀]