蛋白質(zhì)組學(xué)

　　研究介紹

　　蛋白質(zhì)組的研究不僅能為生命活動規(guī)律提供物質(zhì)基礎(chǔ)，也能為眾多種疾病機理的闡明及攻克提供理論根據(jù)和解決途徑。通過對正常個體及病理個體間的蛋白質(zhì)組比較分析，我們可以找到某些"疾病特異性的蛋白質(zhì)分子"，它們可成為新藥物設(shè)計的分子靶點，或者也會為疾病的早期診斷提供分子標志。確實，那些世界范圍內(nèi)銷路最好的藥物本身是蛋白質(zhì)或其作用靶點為某種蛋白質(zhì)分子。因此，蛋白質(zhì)組學(xué)研究不僅是探索生命奧秘的必須工作，也能為人類健康事業(yè)帶來巨大的利益。蛋白質(zhì)組學(xué)的研究是生命科學(xué)進入后基因時代的特征。

　　基本策略

　　蛋白質(zhì)組(Proteome)的概念最先由MarcWilkins提出，指由一個基因組(genome)，或一個細胞、組織表達的所有蛋白質(zhì)(Protein).蛋白質(zhì)組的概念與基因組的概念有許多差別，它隨著組織、甚至環(huán)境狀態(tài)的不同而改變.在轉(zhuǎn)錄時，一個基因可以多種mRNA形式剪接，并且，同一蛋白可能以許多形式進行翻譯后的修飾.故一個蛋白質(zhì)組不是一個基因組的直接產(chǎn)物，蛋白質(zhì)組中蛋白質(zhì)的數(shù)目有時可以超過基因組的數(shù)目.蛋白質(zhì)組學(xué)(Proteomics)處于早期“發(fā)育”狀態(tài)，這個領(lǐng)域的專家否認它是單純的方法學(xué)，就像基因組學(xué)一樣，不是一個封閉的、概念化的穩(wěn)定的知識體系，而是一個領(lǐng)域.蛋白質(zhì)組學(xué)集中于動態(tài)描述基因調(diào)節(jié)，對基因表達的蛋白質(zhì)水平進行定量的測定，鑒定疾病、藥物對生命過程的影響，以及解釋基因表達調(diào)控的機制.作為一門科學(xué)，蛋白質(zhì)組研究并非從零開始，它是已有20多年歷史的蛋白質(zhì)(多肽)譜和基因產(chǎn)物圖譜技術(shù)的一種延伸.多肽圖譜依靠雙向電泳(Two-dimensionalgelelectrophoresis,2-DE)和進一步的圖象分析；而基因產(chǎn)物圖譜依靠多種分離后的分析，如質(zhì)譜技術(shù)、氨基酸組分分析等.

　　研究基礎(chǔ)

　　90年代初期開始實施的人類基因組計劃，在經(jīng)過各國科學(xué)家近10年的努力下，已經(jīng)取得了巨大的成就。不僅完成了十余種模式生物（從大腸桿菌、釀酒酵母到線蟲）基因組全序列的測定工作，還在2003年提前完成人類所有基因的全序列測定。那么，知道了人類的全部遺傳密碼即基因組序列，就可以任意控制人的生老病死嗎？其實并不是這么簡單?；蚪M學(xué)（genomics）雖然在基因活性和疾病的相關(guān)性方面為人類提供了有力根據(jù),但實際上大部分疾病并不是因為基因改變所造成。并且，基因的表達方式錯綜復(fù)雜，同樣的一個基因在不同條件、不同時期可能會起到完全不同的作用。關(guān)于這些方面的問題，基因組學(xué)是無法回答的。所以，隨著人類基因組計劃的逐步完成，科學(xué)家們又進一步提出了后基因組計劃，蛋白質(zhì)組（proteome）研究是其中一個很重要的內(nèi)容。

　　目前，在蛋白質(zhì)功能方面的研究是極其缺乏的。大部分通過基因組測序而新發(fā)現(xiàn)的基因編碼的蛋白質(zhì)的功能都是未知的，而對那些已知功能的蛋白而言，它們的功能也大多是通過同源基因功能類推等方法推測出來的。有人預(yù)測，人類基因組編碼的蛋白至少有一半是功能未知的。因此，在未來的幾年內(nèi)，隨著至少30種生物的基因組測序工作的完成，人們研究的重點必將轉(zhuǎn)到蛋白質(zhì)功能方面，而蛋白質(zhì)組的研究正可以完成這樣的目標。在蛋白質(zhì)組的具體應(yīng)用方面，蛋白質(zhì)在疾病中的重要作用使得蛋白質(zhì)組學(xué)在人類疾病的研究中有著極為重要的價值。

　　基因組(genome)包含的遺傳信息經(jīng)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生mRNA，一個細胞在特定生理或病理狀態(tài)下表達的所有種類的mRNA稱為轉(zhuǎn)錄子組(transcriptome)。很顯然，不同細胞在不同生理或病理狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄子組包含的mRNA的種類不盡相同。mRNA經(jīng)翻譯產(chǎn)生蛋白質(zhì)，一個細胞在特定生理或病理狀態(tài)下表達的所有種類的蛋白質(zhì)稱為蛋白質(zhì)組(proteome)。同理，不同細胞在不同生理或病理狀態(tài)下所表達的蛋白質(zhì)的種類也不盡相同。蛋白質(zhì)是基因功能的實施者，因此對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，定位和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的研究將為闡明生命現(xiàn)象的本質(zhì)提供直接的基礎(chǔ)。

　　生命科學(xué)是實驗科學(xué)，因此生命科學(xué)的發(fā)展極大地依賴于實驗技術(shù)的發(fā)展。以DNA序列分析技術(shù)為核心的基因組研究技術(shù)推動了基因組研究的日新月異，而以基因芯片技術(shù)為代表的基因表達研究技術(shù)為科學(xué)家了解基因表達規(guī)律立下汗馬功勞。在蛋白質(zhì)組研究中，二維電泳和質(zhì)譜技術(shù)的黃金組合又為科學(xué)家掌握蛋白質(zhì)表達規(guī)律再鑄輝煌。蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)就是指研究蛋白質(zhì)組的技術(shù)及這些研究得到的結(jié)果。

　　蛋白質(zhì)組學(xué)的研究試圖比較細胞在不同生理或病理條件下蛋白質(zhì)表達的異同，對相關(guān)蛋白質(zhì)進行分類和鑒定。更重要的是蛋白質(zhì)組學(xué)的研究要分析蛋白質(zhì)間相互作用和蛋白質(zhì)的功能。

　　研究內(nèi)容

　　蛋白質(zhì)研究

　　1.蛋白質(zhì)鑒定：可以利用一維電泳和二維電泳并結(jié)合Western等技術(shù)，利用蛋白質(zhì)芯片和抗體芯片及免疫共沉淀等技術(shù)對蛋白質(zhì)進行鑒定研究。

　　2.翻譯后修飾：很多mRNA表達產(chǎn)生的蛋白質(zhì)要經(jīng)歷翻譯后修飾如磷酸化，糖基化，酶原激活等。翻譯后修飾是蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)功能的重要方式，因此對蛋白質(zhì)翻譯后修飾的研究對闡明蛋白質(zhì)的功能具有重要作用。

　　3.蛋白質(zhì)功能確定：如分析酶活性和確定酶底物，細胞因子的生物分析/配基-受體結(jié)合分析?？梢岳没蚯贸头戳x技術(shù)分析基因表達產(chǎn)物-蛋白質(zhì)的功能。另外對蛋白質(zhì)表達出來后在細胞內(nèi)的定位研究也在一定程度上有助于蛋白質(zhì)功能的了解。Clontech的熒光蛋白表達系統(tǒng)就是研究蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)定位的一個很好的工具。

　　4.對人類而言，蛋白質(zhì)組學(xué)的研究最終要服務(wù)于人類的健康，主要指促進分子醫(yī)學(xué)的發(fā)展。如尋找藥物的靶分子。很多藥物本身就是蛋白質(zhì)，而很多藥物的靶分子也是蛋白質(zhì)。藥物也可以干預(yù)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。

　　在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和疾病機理研究中，了解人不同發(fā)育、生長期和不同生理、病理條件下及不同細胞類型的基因表達的特點具有特別重要的意義。這些研究可能找到直接與特定生理或病理狀態(tài)相關(guān)的分子，進一步為設(shè)計作用于特定靶分子的藥物奠定基礎(chǔ)。

　　細胞亞細胞

　　不同發(fā)育、生長期和不同生理、病理條件下不同的細胞類型的基因表達是不一致的，因此對蛋白質(zhì)表達的研究應(yīng)該精確到細胞甚至亞細胞水平?？梢岳妹庖呓M織化學(xué)技術(shù)達到這個目的，但該技術(shù)的致命缺點是通量低。激光捕獲顯微切割LCM(LaserCaptureMicrodissection)技術(shù)可以精確地從組織切片中取出研究者感興趣的細胞類型，因此LCM技術(shù)實際上是一種原位技術(shù)。取出的細胞用于蛋白質(zhì)樣品的制備，結(jié)合抗體芯片或二維電泳-質(zhì)譜的技術(shù)路線，可以對蛋白質(zhì)的表達進行原位的高通量的研究。很多研究采用勻漿組織制備蛋白質(zhì)樣品的技術(shù)路線，其研究結(jié)論值得懷疑，因為組織勻漿后不同細胞類型的蛋白質(zhì)混雜在一起，最后得到的研究數(shù)據(jù)根本無法解釋蛋白質(zhì)在每類細胞中的表達情況。雖然培養(yǎng)細胞可以得到單一類型細胞，但體外培養(yǎng)的細胞很難模擬體內(nèi)細胞的環(huán)境，因此這樣研究得出的結(jié)論也很難用于解釋在體實際情況。因此在研究中首先應(yīng)該將不同細胞類型分離，分離出來的不同類型細胞可以用于基因表達研究，包括mRNA和蛋白質(zhì)的表達。

　　LCM技術(shù)獲得的細胞可以用于蛋白質(zhì)樣品的制備?？梢愿鶕?jù)需要制備總蛋白，或膜蛋白，或核蛋白等，也可以富集糖蛋白，或通過去除白蛋白來減少蛋白質(zhì)類型的復(fù)雜程度。相關(guān)試劑盒均有廠商提供。

　　二維電泳

　　蛋白質(zhì)樣品中的不同類型的蛋白質(zhì)可以通過二維電泳進行分離。二維電泳可以將不同種類的蛋白質(zhì)按照等電點和分子量差異進行高分辨率的分離。成功的二維電泳可以將2000到3000種蛋白質(zhì)進行分離。電泳后對膠進行高靈敏度的染色如銀染和熒光染色。如果是比較兩種樣品之間蛋白質(zhì)表達的異同，可以在同樣條件下分別制備二者的蛋白質(zhì)樣品，然后在同樣條件下進行二維電泳，染色后比較兩塊膠。也可以將二者的蛋白質(zhì)樣品分別用不同的熒光染料標記，然后兩種蛋白質(zhì)樣品在一塊膠上進行二維電泳的分離，最后通過熒光掃描技術(shù)分析結(jié)果。

　　膠染色后可以利用凝膠圖像分析系統(tǒng)成像，然后通過分析軟件對蛋白質(zhì)點進行定量分析，并且對感興趣的蛋白質(zhì)點進行定位。通過專門的蛋白質(zhì)點切割系統(tǒng)，可以將蛋白質(zhì)點所在的膠區(qū)域進行精確切割。接著對膠中蛋白質(zhì)進行酶切消化，酶切后的消化物經(jīng)脫鹽/濃縮處理后就可以通過點樣系統(tǒng)將蛋白質(zhì)點樣到特定的材料的表面（MALDI-TOF）。最后這些蛋白質(zhì)就可以在質(zhì)譜系統(tǒng)中進行分析，從而得到蛋白質(zhì)的定性數(shù)據(jù);這些數(shù)據(jù)可以用于構(gòu)建數(shù)據(jù)庫或和已有的數(shù)據(jù)庫進行比較分析。

　　LCM-二維電泳-質(zhì)譜的技術(shù)路線是典型的一條蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)路線，除此以外，LCM-抗體芯片也是一條重要的蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)路線。即通過LCM技術(shù)獲得感興趣的細胞類型，制備細胞蛋白質(zhì)樣品，蛋白質(zhì)經(jīng)熒光染料標記后和抗體芯片雜交，從而可以比較兩種樣品蛋白質(zhì)表達的異同。Clontech最近開發(fā)了一張抗體芯片，可以對378種膜蛋白和胞漿蛋白進行分析。該芯片同時配合了抗體芯片的全部操作過程的重要試劑，包括蛋白質(zhì)制備試劑，蛋白質(zhì)的熒光染料標記試劑，標記體系的純化試劑，雜交試劑等。

　　對于蛋白質(zhì)相互作用的研究，酵母雙雜交和噬菌體展示技術(shù)無疑是很好的研究方法。Clontech開發(fā)的酵母雙雜交系統(tǒng)和NEB公司開發(fā)的噬菌體展示技術(shù)可供研究者選用。

　　關(guān)于蛋白質(zhì)組的研究，也可以將蛋白質(zhì)組的部分或全部種類的蛋白質(zhì)制作成蛋白質(zhì)芯片，這樣的蛋白質(zhì)芯片可以用于蛋白質(zhì)相互作用研究，蛋白表達研究和小分子蛋白結(jié)合研究。Science，Vol.293，Issue5537，2101-2105，September14，2001發(fā)表了一篇關(guān)于酵母蛋白質(zhì)組芯片的論文。該文主要研究內(nèi)容為：將酵母的5800個ORF表達成蛋白質(zhì)并進行純化點樣制作芯片，然后用該芯片篩選鈣調(diào)素和磷脂分子的相互作用分子。

　　最后有必要指出的是，傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)研究注重研究單一蛋白質(zhì)，而蛋白質(zhì)組學(xué)注重研究參與特定生理或病理狀態(tài)的所有的蛋白質(zhì)種類及其與周圍環(huán)境(分子)的關(guān)系。因此蛋白質(zhì)組學(xué)的研究通常是高通量的。適應(yīng)這個要求，蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)研究工具通常都是高度自動化的系統(tǒng)，通量高而速度快，配合相應(yīng)分析軟件和數(shù)據(jù)庫，研究者可以在最短的時間內(nèi)處理最多的數(shù)據(jù)

　　研究意義背景

　　研究意義

　　隨著人類基因組計劃的實施和推進，生命科學(xué)研究已進入了后基因組時代。在這個時代，生命科學(xué)的主要研究對象是功能基因組學(xué)，包括結(jié)構(gòu)基因組研究和蛋白質(zhì)組研究等。盡管現(xiàn)在已有多個物種的基因組被測序，但在這些基因組中通常有一半以上基因的功能是未知的。目前功能基因組中所采用的策略，如基因芯片、基因表達序列分析(Serialanalysisofgeneexpression,SAGE)等，都是從細胞中mRNA的角度來考慮的，其前提是細胞中mRNA的水平反映了蛋白質(zhì)表達的水平。但事實并不完全如此，從DNAmRNA蛋白質(zhì)，存在三個層次的調(diào)控，即轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控(Transcriptionalcontrol)，翻譯水平調(diào)控(Translationalcontrol)，翻譯后水平調(diào)控(Post-translationalcontrol)。從mRNA角度考慮，實際上僅包括了轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控，并不能全面代表蛋白質(zhì)表達水平。實驗也證明，組織中mRNA豐度與蛋白質(zhì)豐度的相關(guān)性并不好，尤其對于低豐度蛋白質(zhì)來說，相關(guān)性更差。更重要的是，蛋白質(zhì)復(fù)雜的翻譯后修飾、蛋白質(zhì)的亞細胞定位或遷移、蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用等則幾乎無法從mRNA水平來判斷。毋庸置疑，蛋白質(zhì)是生理功能的執(zhí)行者，是生命現(xiàn)象的直接體現(xiàn)者，對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的研究將直接闡明生命在生理或病理條件下的變化機制。蛋白質(zhì)本身的存在形式和活動規(guī)律，如翻譯后修飾、蛋白質(zhì)間相互作用以及蛋白質(zhì)構(gòu)象等問題，仍依賴于直接對蛋白質(zhì)的研究來解決。雖然蛋白質(zhì)的可變性和多樣性等特殊性質(zhì)導(dǎo)致了蛋白質(zhì)研究技術(shù)遠遠比核酸技術(shù)要復(fù)雜和困難得多，但正是這些特性參與和影響著整個生命過程。傳統(tǒng)的對單個蛋白質(zhì)進行研究的方式已無法滿足后基因組時代的要求。這是因為：(1)生命現(xiàn)象的發(fā)生往往是多因素影響的，必然涉及到多個蛋白質(zhì)。(2)多個蛋白質(zhì)的參與是交織成網(wǎng)絡(luò)的，或平行發(fā)生，或呈級聯(lián)因果。(3)在執(zhí)行生理功能時蛋白質(zhì)的表現(xiàn)是多樣的、動態(tài)的，并不象基因組那樣基本固定不變。因此要對生命的復(fù)雜活動有全面和深入的認識，必然要在整體、動態(tài)、網(wǎng)絡(luò)的水平上對蛋白質(zhì)進行研究。因此在上世紀90年代中期，國際上產(chǎn)生了一門新興學(xué)科－蛋白質(zhì)組學(xué)（Proteomics），它是以細胞內(nèi)全部蛋白質(zhì)的存在及其活動方式為研究對象?？梢哉f蛋白質(zhì)組研究的開展不僅是生命科學(xué)研究進入后基因組時代的里程碑，也是后基因組時代生命科學(xué)研究的核心內(nèi)容之一。

　　研究背景

　　雖然第一次提出蛋白質(zhì)組概念是在1994年，但相關(guān)研究可以追溯到上世紀90年代中期甚至更早，尤其是80年代初，在基因組計劃提出之前，就有人提出過類似的蛋白質(zhì)組計劃，當時稱為HumanProteinIndex計劃，旨在分析細胞內(nèi)的所有蛋白質(zhì)。但由于種種原因，這一計劃被擱淺。90年代初期，各種技術(shù)已比較成熟，在這樣的背景下，經(jīng)過各國科學(xué)家的討論，才提出蛋白質(zhì)組這一概念。

　　國際上蛋白質(zhì)組研究進展十分迅速，不論基礎(chǔ)理論還是技術(shù)方法，都在不斷進步和完善。相當多種細胞的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫已經(jīng)建立，相應(yīng)的國際互聯(lián)網(wǎng)站也層出不窮。1996年，澳大利亞建立了世界上第一個蛋白質(zhì)組研究中心：AustraliaProteomeAnalysisFacility(APAF)。丹麥、加拿大、日本也先后成立了蛋白質(zhì)組研究中心。在美國，各大藥廠和公司在巨大財力的支持下，也紛紛加入蛋白質(zhì)組的研究陣容。去年在瑞士成立的GeneProt公司，是由以蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫“SWISSPROT”著稱的蛋白質(zhì)組研究人員成立的，以應(yīng)用蛋白質(zhì)組技術(shù)開發(fā)新藥物靶標為目的，建立了配備有上百臺質(zhì)譜儀的高通量技術(shù)平臺。而當年提出HumanProteinIndex的美國科學(xué)家NormsnG.Anderson也成立了類似的蛋白質(zhì)組學(xué)公司，繼續(xù)其多年未實現(xiàn)的夢想。2001年4月，在美國成立了國際人類蛋白質(zhì)組研究組織（HumanProteomeOrganization,HUPO）,隨后歐洲、亞太地區(qū)都成立了區(qū)域性蛋白質(zhì)組研究組織，試圖通過合作的方式，融合各方面的力量，完成人類蛋白質(zhì)組計劃（HumanProteomeProject）。

　　研究技術(shù)

　　可以說，蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展既是技術(shù)所推動的也是受技術(shù)限制的。蛋白質(zhì)組學(xué)研究成功與否，很大程度上取決于其技術(shù)方法水平的高低。蛋白質(zhì)研究技術(shù)遠比基因技術(shù)復(fù)雜和困難。不僅氨基酸殘基種類遠多于核苷酸殘基（20/4）,而且蛋白質(zhì)有著復(fù)雜的翻譯后修飾，如磷酸化和糖基化等，給分離和分析蛋白質(zhì)帶來很多困難。此外，通過表達載體進行蛋白質(zhì)的體外擴增和純化也并非易事，從而難以制備大量的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學(xué)的興起對技術(shù)有了新的需求和挑戰(zhàn)。蛋白質(zhì)組的研究實質(zhì)上是在細胞水平上對蛋白質(zhì)進行大規(guī)模的平行分離和分析，往往要同時處理成千上萬種蛋白質(zhì)。因此，發(fā)展高通量、高靈敏度、高準確性的研究技術(shù)平臺是現(xiàn)在乃至相當一段時間內(nèi)蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的主要任務(wù)。當前在國際蛋白質(zhì)組研究技術(shù)平臺的技術(shù)基礎(chǔ)和發(fā)展趨勢有以下幾個方面：

　　樣品制備

　　通?？刹捎眉毎蚪M織中的全蛋白質(zhì)組分進行蛋白質(zhì)組分析。也可以進行樣品預(yù)分級，即采用各種方法將細胞或組織中的全體蛋白質(zhì)分成幾部分，分別進行蛋白質(zhì)組研究。樣品預(yù)分級的主要方法包括根據(jù)蛋白質(zhì)溶解性和蛋白質(zhì)在細胞中不同的細胞器定位進行分級，如專門分離出細胞核、線粒體或高爾基體等細胞器的蛋白質(zhì)成分。樣品預(yù)分級不僅可以提高低豐度蛋白質(zhì)的上樣量和檢測，還可以針對某一細胞器的蛋白質(zhì)組進行研究。

　　對臨床組織樣本進行研究，尋找疾病標記，是蛋白質(zhì)組研究的重要方向之一。但臨床樣本都是各種細胞或組織混雜，而且狀態(tài)不一。如腫瘤組織中，發(fā)生癌變的往往是上皮類細胞，而這類細胞在腫瘤中總是與血管、基質(zhì)細胞等混雜。所以，常規(guī)采用的癌和癌旁組織或腫瘤與正常組織進行差異比較，實際上是多種細胞甚至組織蛋白質(zhì)組混合物的比較。而蛋白質(zhì)組研究需要的通常是單一的細胞類型。最近在組織水平上的蛋白質(zhì)組樣品制備方面也有新的進展，如采用激光捕獲微解剖(LaserCaptureMicrodissection,LCM)方法分離癌變上皮類細胞。

　　分離和分析

　　利用蛋白質(zhì)的等電點和分子量通過雙向凝膠電泳的方法將各種蛋白質(zhì)區(qū)分開來是一種很有效的手段。它在蛋白質(zhì)組分離技術(shù)中起到了關(guān)鍵作用。如何提高雙向凝膠電泳的分離容量、靈敏度和分辨率以及對蛋白質(zhì)差異表達的準確檢測是目前雙向凝膠電泳技術(shù)發(fā)展的關(guān)鍵問題。國外的主要趨勢有第一維電泳采用窄pH梯度膠分離以及開發(fā)與雙向凝膠電泳相結(jié)合的高靈敏度蛋白質(zhì)染色技術(shù)，如新型的熒光染色技術(shù)。

　　質(zhì)譜技術(shù)是目前蛋白質(zhì)組研究中發(fā)展最快，也最具活力和潛力的技術(shù)。它通過測定蛋白質(zhì)的質(zhì)量來判別蛋白質(zhì)的種類。當前蛋白質(zhì)組研究的核心技術(shù)就是雙向凝膠電泳－質(zhì)譜技術(shù)，即通過雙向凝膠電泳將蛋白質(zhì)分離，然后利用質(zhì)譜對蛋白質(zhì)逐一進行鑒定。對于蛋白質(zhì)鑒定而言，高通量、高靈敏度和高精度是三個關(guān)鍵指標。一般的質(zhì)譜技術(shù)難以將三者合一，而最近發(fā)展的質(zhì)譜技術(shù)可以同時達到以上三個要求，從而實現(xiàn)對蛋白質(zhì)準確和大規(guī)模的鑒定。

　　蛋白質(zhì)組研究

　　做過雙向凝膠電泳的人一定會抱怨它的繁瑣、不穩(wěn)定和低靈敏度等缺點。發(fā)展可替代或補充雙向凝膠電泳的新方法已成為蛋白質(zhì)組研究技術(shù)最主要的目標。目前，二維色譜(2D-LC)、二維毛細管電泳(2D-CE)、液相色譜－毛細管電泳(LC-CE)等新型分離技術(shù)都有補充和取代雙向凝膠電泳之勢。另一種策略則是以質(zhì)譜技術(shù)為核心，開發(fā)質(zhì)譜鳥槍法(Shot-gun)、毛細管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用(CE-MS)等新策略直接鑒定全蛋白質(zhì)組混合酶解產(chǎn)物。隨著對大規(guī)模蛋白質(zhì)相互作用研究的重視，發(fā)展高通量和高精度的蛋白質(zhì)相互作用檢測技術(shù)也被科學(xué)家所關(guān)注。此外，蛋白質(zhì)芯片的發(fā)展也十分迅速，并已經(jīng)在臨床診斷中得到應(yīng)用。

       蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫是蛋白質(zhì)組研究水平的標志和基礎(chǔ)。瑞士的SWISS-PROT擁有目前世界上最大，種類最多的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫。丹麥、英國、美國等也都建立了各具特色的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫。生物信息學(xué)的發(fā)展已給蛋白質(zhì)組研究提供了更方便有效的計算機分析軟件；特別值得注意的是蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定軟件和算法發(fā)展迅速，如SWISS-PROT、Rockefeller大學(xué)、UCSF等都有自主的搜索軟件和數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)。最近發(fā)展的質(zhì)譜數(shù)據(jù)直接搜尋基因組數(shù)據(jù)庫使得質(zhì)譜數(shù)據(jù)可直接進行基因注釋、判斷復(fù)雜的拼接方式。隨著基因組學(xué)的迅速推進，會給蛋白質(zhì)組研究提供更多更全的數(shù)據(jù)庫。另外，對肽序列標記的從頭測序軟件也十分引人注目。

　　蛋白質(zhì)組學(xué)

　　蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展已經(jīng)成為現(xiàn)代生物技術(shù)快速發(fā)展的重要支撐，并將引領(lǐng)生物技術(shù)取得關(guān)鍵性的突破。為幫助生命科學(xué)領(lǐng)域的工作者全面掌握蛋白質(zhì)組學(xué)的技術(shù)與方法、實驗難點與關(guān)鍵點、研究前沿與熱點，本技術(shù)平臺將為客戶提供蛋白組學(xué)技術(shù)服務(wù)，包括雙向凝膠電泳、等電聚焦、生物質(zhì)譜分析及非凝膠技術(shù)。

　　雙向凝膠電泳

　　雙向凝膠電泳的原理是第一向基于蛋白質(zhì)的等電點不同用等電聚焦分離，第二向則按分子量的不同用SDS-PAGE分離，把復(fù)雜蛋白混合物中的蛋白質(zhì)在二維平面上分開。由于雙向電泳技術(shù)在蛋白質(zhì)組與醫(yī)學(xué)研究中所處的重要位置，它可用于蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后修飾研究，蛋白質(zhì)組的比較和蛋白質(zhì)間的相互作用，細胞分化凋亡研究，致病機制及耐藥機制的研究，療效監(jiān)測，新藥開發(fā)，癌癥研究，蛋白純度檢查，小量蛋白純化，新替代疫苗的研制等許多方面。近年來經(jīng)過多方面改進已成為研究蛋白質(zhì)組的最有使用價值的核心方法。

　　等電聚焦

　　等電聚焦（isoelectricfocusing，IEF）是60年代中期問世的一種利用有pH梯度的介質(zhì)分離等電點不同的蛋白質(zhì)的電泳技術(shù)。等電聚焦凝膠電泳依據(jù)蛋白質(zhì)分子的靜電荷或等電點進行分離，等電聚焦中，蛋白質(zhì)分子在含有載體兩性電解質(zhì)形成的一個連續(xù)而穩(wěn)定的線性pH梯度中電泳。載體兩性電解質(zhì)是脂肪族多氨基多羧酸，在電場中形成正極為酸性，負極為堿性的連續(xù)的pH梯度。蛋白質(zhì)分子在偏離其等電點的pH條件下帶有電荷，因此可以在電場中移動；當?shù)鞍踪|(zhì)遷移至其等電點位置時，其靜電荷數(shù)為零，在電場中不再移動，據(jù)此將蛋白質(zhì)分離。

　　生物質(zhì)譜

　　生物質(zhì)譜技術(shù)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中最重要的鑒定技術(shù)，其基本原理是樣品分子離子化后，根據(jù)不同離子之間的荷質(zhì)比（M/E）的差異來分離并確定分子量。對于經(jīng)過雙向電泳分離的目標蛋白質(zhì)用胰蛋白酶酶解（水解Lys或Arg的-C端形成的肽鍵）成肽段，對這些肽段用質(zhì)譜進行鑒定與分析。目前常用的質(zhì)譜包括兩種：基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）和電噴霧質(zhì)譜（ESI-MS）。

　　飛行時間質(zhì)譜

　　MALDI的電離方式是Karas和Hillenkamp于1988年提出。MALDI的基本原理是將分析物分散在基質(zhì)分子（尼古丁酸及其同系物）中并形成晶體，當用激光（337nm的氮激光）照射晶體時，基質(zhì)分子吸收激光能量，樣品解吸附，基質(zhì)-樣品之間發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移使樣品分子電離。它從固相標本中產(chǎn)生離子，并在飛行管中測定其分子量，MALDI-TOF-MS一般用于肽質(zhì)量指紋圖譜，非常快速（每次分析只需3~5min），靈敏（達到fmol水平），可以精確測量肽段質(zhì)量，但是如果在分析前不修飾肽段，MALDI-TOF-MS不能給出肽片段的序列。

　　電噴霧質(zhì)譜

　　ESI-MS是利用高電場使質(zhì)譜進樣端的毛細管柱流出的液滴帶電，在N2氣流的作用下，液滴溶劑蒸發(fā)，表面積縮小，表面電荷密度不斷增加，直至產(chǎn)生的庫侖力與液滴表面張力達到雷利極限，液滴爆裂為帶電的子液滴，這一過程不斷重復(fù)使最終的液滴非常細小呈噴霧狀，這時液滴表面的電場非常強大，使分析物離子化并以帶單電荷或多電荷的離子形式進入質(zhì)量分析器。ESI-MS從液相中產(chǎn)生離子，一般說來，肽段的混合物經(jīng)過液相色譜分離后，經(jīng)過偶聯(lián)的與在線連接的離子阱質(zhì)譜分析，給出肽片段的精確的氨基酸序列,但是分析時間一般較長。

　　目前，許多實驗室兩種質(zhì)譜方法連用，獲得有意義的蛋白質(zhì)的肽段序列，設(shè)計探針或引物來獲得有意義的基因。隨著蛋白質(zhì)組研究的深入，又有多種新型質(zhì)譜儀出現(xiàn)，主要是在上述質(zhì)譜儀的基礎(chǔ)上進行改進與重新組合。

　　發(fā)展回顧

　　核酸與蛋白質(zhì)是構(gòu)成生物體的主要大分子。隨著人類基因組等大量生物體全基因組序列的破譯和功能基因組研究的展開，生命科學(xué)家越來越關(guān)注如何用基因組研究的模式開展蛋白質(zhì)組學(xué)的研究。正因如此，《Nature》、《Science》在2001年2月公布人類基因組草圖的同時，分別發(fā)表了“Andnowfortheproteome”和“Proteomicsingenomeland”的述評與展望，將蛋白質(zhì)組學(xué)的地位提到前所未有的高度，認為蛋白質(zhì)組學(xué)將成為新世紀最大戰(zhàn)略資源---人類基因爭奪戰(zhàn)的戰(zhàn)略制高點之一。蛋白質(zhì)組學(xué)雖然問世時間很短，但已經(jīng)在研究細胞的增殖、分化、異常轉(zhuǎn)化、腫瘤形成等方面進行了有力的探索，涉及到白血病、乳腺癌、結(jié)腸癌、膀胱癌、前列腺癌、肺癌、腎癌和神經(jīng)母細胞瘤等，鑒定了一批腫瘤相關(guān)蛋白，為腫瘤的早期診斷、藥靶的發(fā)現(xiàn)、療效判斷和預(yù)后提供了重要依據(jù)。

　　鑒于蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)展前景的重要性和技術(shù)的先進性，西方各主要發(fā)達國家紛紛投巨資全面啟動蛋白質(zhì)組的研究。如美國國立衛(wèi)生研究院，美國能源部、歐共體等均啟動了不同生物蛋白質(zhì)組的研究并取得明顯進展，一批高質(zhì)量的研究論文相繼在國際著名學(xué)術(shù)刊物發(fā)表。由于蛋白質(zhì)組學(xué)研究比基因組學(xué)研究更接近實用，有著巨大的市場前景，企業(yè)與制藥公司也紛紛斥巨資開展蛋白質(zhì)組研究。獨立完成人類基因組測序的Celera公司已宣布投資上億美元于此領(lǐng)域；日內(nèi)瓦蛋白質(zhì)組公司與布魯克質(zhì)譜儀制造公司聯(lián)合成立了國際上最大的蛋白質(zhì)組研究中心。為了促進國家與地區(qū)性的蛋白質(zhì)組的發(fā)展、合作與交流，成立了國際人類蛋白質(zhì)組組織(HUPO)，在法國召開了首屆國際蛋白質(zhì)組大會，并迅即在北美、歐洲、韓國、日本成立了相應(yīng)的分支機構(gòu)。蛋白質(zhì)組學(xué)已成為西方各主要發(fā)達國家、各跨國制藥集團競相投入的“熱點”。

　　主要進展

　　啟動研究

　　在國家支持下，中國科學(xué)院生物化學(xué)研究所、軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院、復(fù)旦大學(xué)與北京師范大學(xué)等單位迅速啟動了蛋白質(zhì)組研究，建立并組合了二維電泳蛋白質(zhì)組分離技術(shù)、圖象分析技術(shù)和蛋白質(zhì)鑒定的質(zhì)譜技術(shù)；先后舉辦了三次全國性的蛋白質(zhì)組學(xué)術(shù)研討會，并在國際上較早提出了功能蛋白質(zhì)組學(xué)的研究戰(zhàn)略。我國蛋白質(zhì)的色譜/電泳二維分離，二維芯片電泳分離，質(zhì)譜在線鑒定等方面均取得了重要進展，并得到了國際同行的認同，具有一定優(yōu)勢。其中由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院牽頭的“人類肝臟蛋白質(zhì)組計劃”成為世界“人類蛋白質(zhì)組計劃”的重要組成部分之一。

　　重要成就

　　雖然我國蛋白質(zhì)組學(xué)研究啟動不久，我國科學(xué)家已經(jīng)在重大疾病如肝癌、維甲酸誘導(dǎo)白血病細胞凋亡啟動模型及維甲酸定向誘導(dǎo)胚胎干細胞向神經(jīng)系統(tǒng)分化的模型等比較蛋白質(zhì)組研究以及一些重要生理和病理體系的蛋白質(zhì)組成分研究方面獲得了重要成就。在胚胎干細胞誘導(dǎo)向神經(jīng)干細胞方向分化前后分離出了19個與定向誘導(dǎo)神經(jīng)分化相關(guān)的蛋白；在HL-60細胞凋亡研究中初步篩選到21個凋亡相關(guān)蛋白。已進行了肝癌細胞系及正常肝細胞蛋白質(zhì)組的比較分析研究，發(fā)現(xiàn)了兩者間不同的蛋白表達群；自行建立了肝癌高/低轉(zhuǎn)移細胞系，進行了原位食管癌/轉(zhuǎn)移食管癌間的比較蛋白質(zhì)組研究，初步發(fā)現(xiàn)了一批與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白質(zhì)群。通過蛋白質(zhì)芯片技術(shù)對肺癌病人和正常人血清中的蛋白質(zhì)譜的對比分析，找到了15個差異蛋白并利用BiomarkerPattern分析軟件建立了肺癌診斷分類樹模型。初步盲篩結(jié)果表明，這15個分子標志可能成為臨床診斷肺癌的新指標，有重要應(yīng)用價值。在大規(guī)模人胎肝蛋白表達譜方面初步鑒定出500個高豐度蛋白，150個磷酸化相關(guān)蛋白等等。這些研究證明了我國的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)平臺已能支撐一定規(guī)模的研究，為我國在該研究領(lǐng)域爭得了一席之地，也為未來的發(fā)展奠定了良好的基礎(chǔ)。

　　目前，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院牽頭的973計劃項目和由上海生命科學(xué)院牽頭的863計劃項目集中了國內(nèi)十余家優(yōu)勢單位，針對嚴重影響我國人民健康的重大疾病和重要生命科學(xué)問題開展“重大疾病的比較蛋白質(zhì)組研究”和“重要生理、病理體系的功能蛋白質(zhì)組研究”。力爭在3~5年內(nèi)建立國際領(lǐng)先水平的蛋白質(zhì)組學(xué)研究通用技術(shù)平臺，發(fā)現(xiàn)一批有重要生命科學(xué)價值或與重大疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)，為探索基因轉(zhuǎn)錄,翻譯調(diào)控的規(guī)律、獲得重大疾病預(yù)警、診斷標志物和新藥研究的靶標作出貢獻。

　　目前，國內(nèi)已有若干蛋白質(zhì)組學(xué)研究中心或重點實驗室相繼成立，如復(fù)旦大學(xué)蛋白質(zhì)研究中心，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院蛋白質(zhì)組中心，高等院校蛋白質(zhì)組學(xué)研究院，中國科學(xué)院蛋白質(zhì)組學(xué)重點實驗室和中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院蛋白質(zhì)組學(xué)研究中心等。其中高校蛋白質(zhì)組研究院是由國內(nèi)多所高校、臨床單位和國內(nèi)外有關(guān)公司聯(lián)合建立的研究機構(gòu)，是我國高校大規(guī)模打破學(xué)校界限，與國內(nèi)外多方面力量聯(lián)手，進軍蛋白組組學(xué)研究領(lǐng)域所采取的新舉措。統(tǒng)一協(xié)調(diào)有關(guān)國內(nèi)研究的中國人類蛋白質(zhì)組組織（ChineseHUPO）和蛋白質(zhì)組專業(yè)委員會等也在籌備中。

　　發(fā)展趨勢

　　基礎(chǔ)研究方面

　　近兩年來蛋白質(zhì)組研究技術(shù)已被應(yīng)用到各種生命科學(xué)領(lǐng)域，如細胞生物學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)等。在研究對象上，覆蓋了原核微生物、真核微生物、植物和動物等范圍，涉及到各種重要的生物學(xué)現(xiàn)象，如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞分化、蛋白質(zhì)折疊等等。在未來的發(fā)展中，蛋白質(zhì)組學(xué)的研究領(lǐng)域?qū)⒏訌V泛。

　　應(yīng)用研究方面

　　蛋白質(zhì)組學(xué)將成為尋找疾病分子標記和藥物靶標最有效的方法之一。在對癌癥、早老性癡呆等人類重大疾病的臨床診斷和治療方面蛋白質(zhì)組技術(shù)也有十分誘人的前景，目前國際上許多大型藥物公司正投入大量的人力和物力進行蛋白質(zhì)組學(xué)方面的應(yīng)用性研究。

　　技術(shù)發(fā)展方面

　　蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法將出現(xiàn)多種技術(shù)并存，各有優(yōu)勢和局限的特點，而難以象基因組研究一樣形成比較一致的方法。除了發(fā)展新方法外，更強調(diào)各種方法間的整合和互補，以適應(yīng)不同蛋白質(zhì)的不同特征。另外，蛋白質(zhì)組學(xué)與其它學(xué)科的交叉也將日益顯著和重要，這種交叉是新技術(shù)新方法的活水之源，特別是，蛋白質(zhì)組學(xué)與其它大規(guī)?？茖W(xué)如基因組學(xué)，生物信息學(xué)等領(lǐng)域的交叉，構(gòu)成組學(xué)（omics）生物技術(shù)研究方法，所呈現(xiàn)出的系統(tǒng)生物學(xué)（SystemBiology）研究模式，將成為未來生命科學(xué)最令人激動的新前沿。